Impedanční průtoková cytometrie a její využití při monitorování prostředí, kde jsou zpracovávány potraviny

Klasické metody běžně využívané v potravinářských provozech mají svá omezení. Výrobci potravin potřebují rychlou metodu, která přímo kvantifikuje jak bakterie, tak zbytkové částice a která nebude ovlivněna dezinfekčními prostředky a teplotou. Ačkoli se to zdá být nedosažitelné, základní technologie, které to umožňují, již dnes existují a používají se. Jako svatý grál ověřování čištění a dezinfekce může být považována průtoková cytometrie. Představujeme vám řešení, které je praktické, snadno použitelné a dostatečně přesné - systém CytoQuant^®.

Mobilní průtokový cytometr CytoQuant® umožňuje okamžité ověření čisticích a dezinfekčních postupů na místě v potravinářských provozech nebo v jiných oblastech, kde je hygiena zásadní, přičemž se využívá kvantifikování bakterií a zbytkových částic na povrchu

Bezpečnost potravin závisí z velké části na hygienických podmínkách v potravinářských provozech. Vysoké množství bakterií způsobujících kažení může ovlivnit trvanlivost a kvalitu potravin, zatímco přítomnost patogenů (např. Salmonel aLlisterií) může vést k závažným onemocněním. Výrobci potravin musí pečlivě dbát na čistotu zpracovatelského prostředí bez patogenních mikroorganismů, aby zabránili křížové kontaminaci konečného výrobku. Jak se to ale v současnosti dělá?

Vizuální kontrola

Vizuální kontrola je sice nezbytným předpokladem, ale sama o sobě není dostačující. Jedná se o subjektivní a nepřesný způsob ověření správného čištění. Důležitější je, že i když na povrchu nejsou patrné žádné zbytky, neznamená to, že je bezvadný. Vizuální kontrola nemůže zaručit, že byly odstraněny všechny zbytky potravin z předchozího provozu, nebo že dezinfekční prostředek účinně snížil hladinu mikrobů na povrchu.

Mikrobiální enumerace pomocí kultivačních metod

Jedná se o tradiční metody monitorování hygieny ve zpracovatelském prostředí. Obecně existují dva způsoby odběru vzorků: kontaktní a stěry. Při kontaktních metodách se na povrch, z něhož se odebírají vzorky, umístí kontaktní misky nebo otiskové dip-slidy, jež se následně inkubují. Odběr vzorků stěrem se provádí pomocí tamponů nebo houbiček, které se opláchnou v pufrovacím roztoku, a ten se následně vloží do sterilního média a inkubuje. Hlavním omezením těchto tradičních metod stanovení mikrobů je doba potřebná k získání výsledků. Většinu druhů bakterií navíc nelze kultivovat na agaru, což je jev známý jako velká anomálie počtu na plotnách.

Detekce ATP

Adenosintrifosfát (ATP) je nukleotid, který buňky využívají k dodávání energie. Lze si jej představit jako molekulární „měnovou jednotku“ pro energii ve všech živých buňkách. Energie se přenáší při rozpadu ATP na nukleosid a volný fosfát. Hydrolýzou kovalentních vazeb fosfátů se uvolňuje energie, která se využívá k reakcím. Komerční testovací systémy ATP využívají reakci luciferin/luciferáza, která je v přírodě velmi rozšířená a generuje světlo pomocí energie dodané ATP. Čím více světla je emitováno, tím více je přítomen ATP, což by mohlo nepřímo znamenat více zbytků potravin nebo (potenciálně) více mikroorganismů. Přesto existuje jedno důležité upozornění: protože jsou tyto systémy závislé na enzymatické reakci, potenciální inhibitory nebo méně optimální podmínky prostředí by mohly vést k chybným výsledkům. Teplota prostředí by mohla prodloužit reakční dobu, zatímco světlo by mohlo ztížit získání správných údajů. Navíc dezinfekční prostředky mohou tuto reakci narušovat, což znamená, že mezi živými bakteriemi přítomnými na povrchu a výsledky měření ATP nemusí být skutečná souvislost. Proto se k testování povrchů před použitím dezinfekčního prostředku obvykle používají metody založené na ATP.

 Metody s ATP mají další nevýhodu: jejich použitelnost závisí na povaze zpracovávané potraviny. Většina potravin zanechává zbytky obsahující velké množství ATP, které o několik řádů převyšuje množství obsažené v bakteriálních buňkách. Prakticky to znamená, že systémy ATP nelze použít k hodnocení mikrobiální kontaminace povrchů ve většině potravinářských provozů. Přestože nelze přímo počítat bakterie, systémy ATP jsou hojně využívány, protože výsledky jsou generovány během několika sekund, což je doba, za kterou je možné získat výsledek, který dosud nebyl k dispozici u žádné jiné běžně dostupné technologie.

„Výrobci potravin potřebují rychlou metodu, která přímo kvantifikuje bakterie a zbytkové částice a nebude ovlivněna dezinfekčními prostředky a teplotou."

Představení průtokové cytometrie

Průtoková cytometrie (FCM) označuje skupinu technik využívajících optické nebo elektrické signály k detekci a měření určitých fyzikálních nebo chemických vlastností buněk a částic suspendovaných v tekutině. Téměř 300 studií provedených v letech 2000–2018 hodnotilo FCM jako nástroj pro charakterizaci mikrobiální kvality vody. Tento výzkum dokázal ilustrovat hodnotu FCM při úpravě, distribuci a opětovném využití vody. V současné době existuje řada výzkumů, které dokumentují úspěšnou aplikaci průtokové cytometrie jako dostatečně robustní, aby bylo možné předpokládat, že by se mohla racionálně a reálně rozšířit jako běžná metoda hodnocení kvality vody.

Jak to souvisí s hodnocením účinnosti čištění a dezinfekce v potravinářských provozech? Metody dříve běžné při stanovení kvality vody byly často omezeny nízkou citlivostí, vysokou pracností a časovou náročností, náchylností k rušivým vlivům inhibičních látek a obtížemi při rozlišování životaschopných a neživotaschopných buněk. Bohužel jsou ale klasické fluorescenční průtokové cytometry obecně těžkopádná a drahá zařízení, jejichž obsluha vyžaduje vysoce kvalifikovaný personál.

Využití výkonu průtokové cytometrie v kapesním zařízení 

Aby se průtoková cytometrie stala efektivním řešením pro ověřování čistoty v potravinářských provozech, musí se se jednat o zařízení, které je přenosné, jednoduché a snadno použitelný, ale zároveň dostatečně přesné, aby poskytovalo spolehlivé počty bakterií a zbytkových částic ve vzorcích z prostředí. To je umožněno použitím impedanční průtokové cytometrie, která je specifický druh průtokové cytometrie: místo optických systémů, jako je laserová technologie, využívají impedanční průtokové cytometry střídavý proud o různých frekvencích, což umožňuje zařízení odděleně detekovat a počítat buňky a zbytkové částice. Zatímco průtokové cytometry na optické bázi jsou schopny počítat pouze buňky označené barvivy, impedanční průtokové cytometry dokáží provádět stejnou operaci bez nutnosti značení. Ve srovnání s jinými průtokovými cytometrickými přístroji jsou kompaktní, přenosné a napájené bateriemi, což umožňuje jejich použití na místě odběru vzorku.

Jak mohou impedanční průtokové cytometry rozlišovat mezi buňkami a zbytkovými částicemi?

Elektromagnetické vlastnosti bakterií umožňují průtokovým cytometrem jejich rozlišení od ostatních částic. Cytoplazma a buněčná membrána bakterií mění jedinečným a identifikovatelným způsobem elektrické pole. Zatímco elektrický proud prochází kovovými částicemi většinou nerušeně, nevodivé částice se poli brání. Neporušené bakterie však obsahují jak nevodivé, tak vodivé částice: buněčná membrána brání průniku nízkých frekvencí, takže se podobají nevodivým částicím; při vysokých frekvencích však elektrický proud membránou proniká. Mikroelektrody v impedančním průtokovém cytometru vytvářejí tato elektrická pole a umožňují zařízení kvantifikovat změny vodivosti a odporu ve smyslu oddělených měření neporušených buněk a částic.

Impedanční průtokové cytometry využívají střídavý proud o různých frekvencích, který umožňuje zařízení detekovat a počítat buňky a zbytkové částice odděleně.

Použití impedanční průtokové cytometrie v oblasti bezpečnosti potravin: představení systému CytoQuant^® 

Jak bylo uvedeno výše, jednou z výhod impedančních průtokových cytometrů oproti jiným druhům cytometrických zařízení je jejich přenosnost. Jsou lehké, malé a napájené bateriemi, takže mohou pracovat v terénu a na kritických kontrolních místech, kde je hygiena prvořadým úkolem.

Impedanční průtokový cytometrCytoQuant^® je určen pro použití právě v těchto oblastech, včetně potravinářských výrobních provozů a čistých prostor. Impedanční průtoková cytometrie přináší výrobcům potravin, kteří chtějí ověřit bezpečnost svých programů čištění potravin, značné výhody: 

• rychlé a oddělené kvantifikování bakterií a zbytkových částic (které mohou sloužit jako indikátor účinnosti čištění)
• citlivost metody a robustnost soupravy pro stěr a samotného cytometru. 
  
  

Jak systém funguje? 

Použití systému CytoQuant^® je vemi jednoduché, protože přístroj zvládá veškerou práci kromě odběru vzorků. Testování začíná stěrem z předem definované plochy (např. 20 x 20 cm nebo 8 x 8 palců) testovaného povrchu. Pokračuje vložením tamponu do zkumavky obsahující patentovaný vodivý roztok a následným protřepáním sady tamponů, aby se bakterie suspendovaly. Při testování oplachových vod se vzorek umístí přímo do prázdné lahvičky a poté se přidá několik kapek roztoku elektrolytu. Po promíchání vzorku vloží uživatel lahvičku do přístroje CytoQuant^® . Dnem zkumavky proniknou dvě jehly, která spojí kapalinu s průtokovým systémem v zařízení. Jakmile se roztok dostane do průtokového systému, prochází elektrodami v průtokové kyvetě. Po 30 sekundách přístroj zaznamená oddělené výsledky pro bakterie a částice a uvede je na obrazovce.

Jak impedanční průtokové cytometry identifikují bakterie

obr vlevo - Bakterie (červeně) a další částice proudí mikrokanálem cytometru.

obr vpravo - Mikroelektrody v mikrofluidním průtokovém kanálu vytváří elektrická pole o vysokých a nízkých frekvencích.

obr. vlevo - Bakterie a jiné částice ovlivňují elektrické pole při proudění mezi elektrodami

obr vpravo - Jedinečná stopa bakterií - elektrické pole může proniknout buněčnou membránou bakterie pouze při vysokých frekvencích. Při nízkých frekvencích tomu brání izolační vlastnosti membrány.

Revoluce, nebo evoluce? 

Mobilní průtokový cytometr CytoQuant® umožňuje okamžité ověření čisticích a dezinfekčních postupů na místě v potravinářských provozech nebo v jiných oblastech, kde je hygiena zásadní, přičemž se využívá kvantifikování bakterií a zbytkových částic na povrchu. Přímá kvantifikace bakterií a zbytkových částic na povrchu bez negativního vlivu dezinfekčních prostředků nebo teploty přináší podstatné výhody oproti přístrojům ATP a díky 30sekundovému času do dosažení výsledku je dokonalým rozšířením hygienických programů, které již používají kultivační metody. 

Společnost O.K. SERVIS BioPro dodává již více než 30 let přístroje pro kontrolu kvality v potravinářství. V našem portfoliu najdete také širokou škálu přístrojů a diagnostických kitů pro kontrolu povrchů. Přístroj CytoQuant®považujeme za metodu rovnocennou kultivační metodám přinášející opravdovou revoluci do oboru kontroly prostředí. Naši odborní poradci vám rádi poradí a poskytnou podrobnější informace. Ke všem přístrojům zajišťujeme také servisní služby.

Florin Soptica, Romer Labs, 

Tomáš Černý O.K. SERVIS BioPro

www.biopro.cz

Tel: +420 724 440 782, t.cerny@oks.cz